一.細胞介紹

腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的主要組成成分，能夠限制可溶性物質(zhì)和細胞等從血液進入大腦。大腦微血管內(nèi)皮細胞與外周內(nèi)皮細胞相比具有一些相同特性。腦微血管內(nèi)皮細胞存在許多細胞間緊密連接，產(chǎn)生很高的跨內(nèi)皮阻抗，延遲細胞旁的通量；腦微血管的內(nèi)皮細胞間銜接得十分緊密，不象其他組織的血管內(nèi)皮細胞那樣有較大的縫隙腦微血管內(nèi)皮細胞缺乏內(nèi)皮細胞的窗孔結(jié)構(gòu)，其液相物質(zhì)胞飲水平較低；腦微血管內(nèi)皮細胞具有不對稱定位酶和載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，從而產(chǎn)生 “兩極分化”的表現(xiàn)型。 與外周內(nèi)皮細胞相同，大腦微血管內(nèi)皮細胞表面表達細胞粘附分子，調(diào)控白細胞進入大腦。由于微血管內(nèi)皮細胞的器官特異性，內(nèi)皮細胞通常取源于疾病研究的相關(guān)組織。該細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。

二.細胞特性

（1）來源：實驗動物的腦組織。

（2）形態(tài)：鋪路石狀細胞，不規(guī)則細胞，貼壁培養(yǎng)。

（3）細胞鑒定：血管假性血友病因子（vWF）免疫熒光染色為陽性。

（4）不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。

三.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

（1）永生化鴨腦微血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)，建議使用本公司配套的專用培養(yǎng)基和正確的培養(yǎng)方法來解凍、傳代，以此保證細胞具備良好的增殖和分化能力。推薦使用：原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（貨號：PM-002）。

（2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

（3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

四.運輸和保存

（1）凍存細胞：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）復(fù)蘇好的活細胞：T25瓶復(fù)蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

五.產(chǎn)品用途

本產(chǎn)品只提供給進一步的科研使用，不可應(yīng)用于治療等其他方面。

細胞接收后的處理：

（1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

（2）請在4或5x顯微鏡下確認(rèn)細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

（3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

（4）注意：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。

細胞處理：

（1）凍存細胞的復(fù)蘇：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

（2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8mL按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

（3）細胞凍存：收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面以T25瓶為例：

（1）細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個活細胞/mL。

（2）1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1mL凍存液含1×10?~1×10?個活細胞/mL分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

（3）將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存，同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。