細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)沉淀主要有2大原因：

一，細胞本身被污染;

二，培養(yǎng)基中有金屬、蛋白和其他培養(yǎng)基組分的沉淀;

首先，我們先來看看細胞污染。

1，細菌/真菌/酵母污染

細菌、真菌和酵母污染相對來說“道行尚淺”，是因為它們容易被肉眼和顯微鏡識別，如下圖：

在這三種污染重，細菌污染是三者之中個性較強的一位，有一定的辨別難度，常見的細菌有：桿狀菌、球狀菌和螺旋狀菌。

2，支原體污染

支原體可是細胞的天敵，這是因為支原體的平均直徑只有 0.1~0.3 m ，這在顯微鏡下都無法識別。

并且，由于支原體污染初期生長緩慢，更是沒有肉眼可以觀察到的現(xiàn)象。

檢測：常用的檢查方法為培養(yǎng)檢測法，即取1mL細胞培養(yǎng)液加入支原體液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天后，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。如果變黃則懷疑該細胞受到支原體污染。如果不變色，則盲傳一代。

若顏色變黃，可接支原體固體培養(yǎng)基，于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天，觀察有無“煎蛋”狀支原體菌落。一旦發(fā)生污染即淘汰該細胞和培養(yǎng)液。

圖：支原體污染 (左側：電鏡照片(×30k); 右側：電鏡照片(×12k))

此外，支原體污染還可用熒光染色法和相差顯微鏡觀察法等檢測方法,或者直接購買支原體檢測試劑盒進行檢測。

處理措施：

●定期用支原體試劑盒檢測;

●換液可以減緩污染情況，但無法根除;

●支原體清除試劑盒可以達到較好效果;

●小鼠腹腔巨噬細胞清除法。

3，真核細胞污染

真核細胞污染是指一個細胞系中混入了其它細胞。由于各種細胞的外形大小差異甚微，這種污染同樣很難被識別。

一般碰到這種情況，只能是將細胞丟棄了，因為這將對會對實驗結果可重復性產生重大的影響。

接下來，我們來看看培養(yǎng)基的問題。

如果排除了污染，細胞培養(yǎng)基中的渾濁通常被解釋為金屬、蛋白和其他培養(yǎng)基組分的沉淀，沉淀物可能損害細胞健康，因為他們通過螯合可移除養(yǎng)分和其他需要的組分，從而改變培養(yǎng)基的組成。

產生沉淀的可能原因及解決方案：

1，溫度變化

在細胞培養(yǎng)中，溫度是引起沉淀的主要因素之一。當遭遇溫度的極端變化時，高分子量血漿蛋白會從溶液中析出;

解決方案：

大家在培養(yǎng)細胞時一定要注意按照說沒事要求選擇佳的培養(yǎng)基儲存和操作方法，并且要避免反復凍融。

2，失水誘導的濃度改變

如果培養(yǎng)基可能蒸發(fā)，培養(yǎng)基組分(包括鹽) 的濃度將會增加，特別是培養(yǎng)基表面可能容易形成

晶體沉淀。

解決方案：

●確保培養(yǎng)瓶/板不經歷蒸發(fā)，監(jiān)測孵育箱加濕效果;

●密封培養(yǎng)器皿避免脫水。

3，鈣鹽

制備無血清培養(yǎng)基時，組分添加的順序可能導致不可溶分子的形成。鈣鹽尤其容易沉淀，比如CaCl2和MgSO4在溶液中反應產生CaSO4晶體。高壓滅菌和pH值不穩(wěn)定會加劇這一問題。

解決方案：

●逐個添加其它培養(yǎng)基組分之前，用去水離子水單獨溶解CaCl2

●可添加緩沖液避免滲透壓的變化。

4，金屬補充物

銅、鐵和鋅等金屬離子是細胞生長所必需的，是無血清培養(yǎng)基的重要補充物。

培養(yǎng)系統(tǒng)中其他血清組分的缺失可能導致這些金屬沉淀，為細胞形成有毒的環(huán)境。

在較高pH環(huán)境下(一般>8時)，碳酸鹽和氫氧根離子與銅離子、磷酸鹽和氫氧根離子與鐵離子、碳酸鹽、磷酸鹽和氫氧根離子與鋅離子、氫氧根離子與鎂離子易形成不溶性沉淀物;

在氧化條件下，銅和鋅更易于沉淀。

金屬沉淀物對照顏色表

解決方案：

●鐵結合蛋白轉鐵蛋白的加入可防止鐵在培養(yǎng)中沉淀;

●可添加緩沖液避免滲透壓的變化。

●向培養(yǎng)基中補充甘露醇或丙酮酸以結合過氧化氫，盡可能降低氧化應激。

學會對各種污染情況的辨別和處理是一項不可或缺的實驗技能，希望大家在看完我們的文章后結合你的實驗操作，學會如何應對細胞污染。