ASPC-1/GEM人轉移胰腺腺癌細胞吉西他濱耐藥株

產品編號：CL-364h

一、細胞簡介

一個胰腺癌病人的腹水中的細胞移植到裸鼠后建立了這個細胞株。 

細胞耐藥誘導過程：

待細胞生長穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導劑量，每個劑量保持至細胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。約10個月后，細胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩(wěn)定生長，視為耐藥細胞株構建成功，并命名為ASPC-1/GEM。
注意：復蘇細胞充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基，收到細胞后請及時更換為完全培養(yǎng)基，建議收到細胞后，首先進行擴增，并凍存部分細胞以備用。

二、細胞特性

來源：ASPC-1耐藥篩選

形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長

含量：>1x10?cells

規(guī)格：T25瓶x1（常溫運輸）/含有1mL細胞懸液的凍存管x2（干冰運輸）

用途：本產品僅供實驗室研究使用，不可用于動物或人類治療或診斷用途

三、完全培養(yǎng)基配制

1) GEM藥物的配制及保存：建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液，即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物，使其完全溶解。

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復凍融導致藥物失效。溶解后的GEM，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2) 該細胞完全培養(yǎng)基為：DMEM培養(yǎng)基 + 優(yōu)質胎牛血清10% + 雙抗1% + GlutaMAX-1谷氨酰胺1% + GEM（0~18μg/mL）

3) 培養(yǎng)環(huán)境：37℃，95% Air，5% CO?

4) 凍存液：90%血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配

四、細胞接收注意事項

1) 收到細胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液體溢出及細胞有污染，凍存細胞若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落，請拍照后及時與我們聯(lián)系。

2) 在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)時，最好在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行，能準確判斷細胞的傳代密度?？醇毎男螒B(tài)請在10X和20×物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

3) 觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于培養(yǎng)箱放置約2-3h。

4) 對于貼壁生長的細胞：①靜置后顯微鏡下觀察細胞生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在運輸過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。②若細胞匯合度未超過80%，可去除培養(yǎng)瓶中舊液（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中），加入新的完全培養(yǎng)基6-8mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（若培養(yǎng)瓶為密封瓶蓋須擰松瓶蓋）。③若細胞匯合度超過80%，可進行傳代處理（若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收），首次傳代，建議 1:2 傳代（兩個T25）。

細胞培養(yǎng)操作步驟說明

（一）凍存細胞復蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3-5分鐘，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：①細胞復蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的GEM濃度。②建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩，避免凍存管因溫差變化發(fā)生爆炸造成人員傷害。

（二）細胞傳代

細胞密度達到80%-90%時，即可進行傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）。

① 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。

② 加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。

③ 將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

④ 向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于 2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下 觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：細胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的GEM濃度。

（三）細胞凍存

① 細胞凍存時，步驟同細胞傳代的①~③，細胞計數(shù)后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照 1×10? ~ 1×10?個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

② 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍 存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項：

所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全柜內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。